嵌合抗原受体自然杀伤细胞（CAR-NK）疗法，作为CAR-T细胞疗法之外最受瞩目的“现货型”细胞免疫治疗手段，正在改变血液肿瘤的治疗格局。然而，与CAR-T不同，NK细胞在患者体内的半衰期较短（约两周，而异体NK细胞通常仅存活数天至数周，中位时间约7天），因此临床方案往往需要高剂量（≥10⁷细胞/公斤体重）且反复输注才能维持疗效。这就对NK细胞的体外制造能力提出了严苛要求：必须能够以可接受的成本，生产出数十亿乃至百亿级别的高杀伤活性NK细胞。

中国科研实验室动物研究所的革命性突破

近期，中国科研实验室动物研究所王金勇研究员、张梦云研究员与中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）竺晓凡研究员合作，在《自然·生物医学工程》（Nature Biomedical Engineering, IF 26.6）上发表了一项里程碑式的研究（Hu et al., 2025，以下简称Hu等人）。

他们开发出一种创新的三步法，从脐带血CD34+造血干/祖细胞（HSPCs）出发，实现了诱导NK细胞（iNK）和CAR-iNK细胞的超大规模、低成本生产，为“现货型”NK细胞疗法的普及应用铺平了道路。

方法设计的初衷：超越现有技术瓶颈

现有的基于细胞因子的HSPC-NK分化体系，每个输入HSPC仅能产生1,879-4,450个NK细胞，且终末细胞表达CD16的比例极低（仅约3%），严重限制了其抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）功能。同时，如何在CAR工程化与高效分化之间取得平衡，也是长期未解的难题。

研究团队正是瞄准了这些瓶颈，设计了整合高密度HSPC扩增、类器官驱动的淋巴谱系特化以及后续NK成熟的一体化封闭系统工艺。

第一阶段：HSPC的超级扩增（Day0 — Day14）

一切始于从脐带血中分离的单个CD34+ HSPC。

研究人员将这些细胞与经照射处理的小鼠骨髓基质细胞系AFT024进行共培养，培养基中添加了优化的细胞因子组合（SCF、FLT3L、TPO等）。AFT024细胞作为滋养层，模拟了骨髓中的造血微环境，给予了促进HSPC自我更新而非分化的关键信号。

经过约14天的共培养，单个CD34+ HSPC可实现惊人的800至1,000倍的扩增，为后续分化储备了海量的“种子细胞”。

基因工程的黄金窗口：值得注意的是，CAR基因的逆转录病毒转导正是在这一早期阶段进行的。由于细胞在扩增前就完成了工程化改造，所需的病毒载体用量被极大地降低——与传统方法（转导成熟NK细胞）相比，病毒用量减少了14万至60万

第二阶段：无饲养层类器官中的谱系分化（Day14 — Day28）

扩增后的HSPCs被转移至另一种小鼠骨髓基质细胞系OP9上共培养。关键在于，在这种共培养条件下，细胞会自发聚集，形成三维的无饲养层类器官聚集体（feeder-free organoid aggregates）。这种3D结构更真实地模拟了胚胎发育期间的造血微环境，顺利获得细胞间的复杂相互作用（特别是Jagged1/Notch1信号通路的激活），高效地引导HSPCs向NK细胞谱系定向分化和发育。这是整个方法的核心创新点，巧妙地将饲养层细胞的支持作用与3D培养的结构优势相结合。

第三阶段：在透气培养袋中的成熟与大规模扩增（Day28 — Day49）

从类器官中释放出来的、已定向于NK谱系的细胞，被转移至透气性培养袋中，在IL-15和IL-2等细胞因子作用下，进入最后的成熟和扩增阶段。透气培养袋的设计允许大规模、封闭式的细胞扩增，符合临床级生产的规范。

▲图：从脐带血CD34⁺造血干细胞和祖细胞大规模生产iNK细胞与CAR-iNK细胞的“三步法”流程示意图

图片来源：王金勇教授实验室

震撼业界的关键数据与突破性成果

仅需1/5个脐带血单位，即可生产出数千剂治疗产品。

Day42：从一个输入的CD34+ HSPC出发，平均可产生1.4×10⁷ ± 0.1×10⁷（约1,400万）个iNK细胞，或7.6×10⁶ ± 1.2×10⁶（约760万）个CD19-CAR-iNK细胞。

Day49：终末收获时，这一数字进一步提升至8.3×10⁷ ± 0.7×10⁷（约8,300万）个iNK细胞，或3.2×10⁷ ± 0.2×10⁷（约3,200万）个CAR-iNK细胞。

以一个典型的脐带血单位含有1-2×10⁶个CD34+细胞计算，该平台理论上可生产出数万亿个CAR-iNK细胞——足以满足数百名患者的治疗需求，其产出的细胞质量和功能可达到：

高纯度：终末产品中CD45⁺CD56⁺CD16⁺ NK细胞纯度>99%，几乎检测不到T细胞污染，确保了安全性。

高CD16表达：与传统细胞因子诱导方案（CD16阳性率仅约3%）不同，该方法产生的iNK和CAR-iNK细胞高表达内源性CD16，意味着它们具备强大的ADCC效应功能，可与治疗性抗体联合使用，发挥双重杀伤机制。

广谱抗肿瘤活性：无论是新鲜制备还是冻存复苏后的iNK和CAR-iNK细胞，均能有效杀伤多种人肿瘤细胞系。

持久的体内疗效：在人B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）等多种肿瘤异种移植模型中，CD19 CAR-iNK细胞不仅抑制了肿瘤生长，更显著延长了荷瘤小鼠的生存期。值得注意的是，即使在实体瘤模型中，冻存复苏后的CAR-iNK细胞在体内仍能维持长达六个月的肿瘤清除活性。

从实验室突破到工业化生产

在这个突破性的培养技术中，NK培养阶段（第三阶段）已实现无饲养层体系纯因子法的培养，然而要将这幅蓝图转化为真正意义上的工业化、临床普及产品，K8凯发国际仍需解决前两阶段的核心工艺瓶颈：异种（小鼠）饲养层细胞的使用。AFT024和OP9虽然功能强大，但它们带来的安全性风险、监管障碍和工艺复杂性，是通往商业化GMP生产道路上的主要关卡。

以下，K8凯发国际整合最新的组织工程学和生物材料研究成果，提出一套将当前方案升级为“下一代”全封闭、自动化、无异种成分生产平台的优化路径。

（注：这些改进建议仅是K8凯发国际对无限可能的畅想和对未来技术演变的期许，不代表成熟方案）

饲养层的人源化与可分离设计

人源间充质干细胞（hMSCs）结合微载体

解决异种细胞问题的直接思路，是用人类来源的细胞替代小鼠细胞。

人源间充质干细胞（hMSCs） 是骨髓微环境中支持造血干/祖细胞（HSPCs）的自然“培育者”。该研究证实，在脐带间充质干细胞（UC-MSC）饲养层和细胞因子（IL-2, IL-15, IL-3, FLT-3L）的共同作用下，脐带血来源的NK前体细胞(progenitors)在培养两周后实现了 64.7±8.4倍的扩增，显著高于仅使用细胞因子的对照组（6.4±1.5倍）。研究还发现，UC-MSC与NK前体细胞之间的直接接触对于促进扩增至关重要（Boissel et al., 2008）。

然而，即使是使用hMSCs做为共培养，且直接接触的饲养层，如何将其与悬浮的HSPCs高效分离，是规模化生产必须解决的问题。

微载体技术恰好能解决这一难题。K8凯发国际可以在搅拌式生物反应器中，将hMSCs培养在直径较大的多孔微载体上，从而构建一个动态且可放大的共培养系统。hMSCs会牢固地粘附在微载体上，而HSPCs则悬浮生长或进入微载体的孔隙内部。因此，当扩增阶段结束时，只需顺利获得简单的沉降或过滤，就能将二者高效分离——彻底告别复杂的流式分选或酶解消化步骤。

从类器官到仿生3D微环境

可溶解多孔微载体的实验证据

当前方案的第二阶段依赖OP9细胞形成的类器官聚集体来模拟骨髓微环境以促进HSPC向NK的分化和发育。而最新研究（Li et al., 2023；Liang et al., 2023）表明，K8凯发国际可以利用仿生学的3D微载体来复刻这一过程，甚至做得更好，同时有完全摆脱动物细胞依赖的潜力。

Li等人（2023）在《Nature Communications》中的研究简化了3D微环境在扩增人类巨核系偏好的造血干细胞（Mk-HSCs）的应用；

Liang等人（2023）在《Bioactive Materials》中的研究给予了关键证据：他们开发了一种基于明胶的可注射3D微凝胶（微载体）系统，将HSPCs与MSCs共培养于其中。这种仿生微支架（微载体）成功复刻了骨髓微环境，显著增强了HSPCs的维持和功能，在急性致死辐射（9.0 Gy）的小鼠模型中，该策略展现出惊人的治疗效果。

这两篇文章的主要发现包括：

惊人的扩增效率：在最适培养条件下（搅拌速度40 rpm，培养3天），单纯添加微载体（没有共培养的细胞）可以分别将CD34⁺、CD34⁺CD38⁻、CD34⁺CD38⁻CD45RA⁻CD90⁺以及CD34⁺CD38⁻CD45RA⁻CD90⁺CD49f⁺ 等HSPC亚群扩增了6.2倍、6.5倍、20.8倍和179倍。这些结果证实了基于微载体的脐带血HSC体外扩增体系具有良好的可放大性。

信号通路的精准调控：3D微环境（micro-Niche)结构有效刺激了Notch信号通路——而Notch信号的激活，恰恰是OP9细胞通常被用来触发淋巴细胞分化的核心机制。3D物理约束与MSCs共培养协同作用，上调了血小板生成素（TPO）信号通路和巨核系相关基因的表达。

干性维持：与2D培养相比，3D微环境中长期造血干细胞（LT-HSCs）的频率提高了3.5倍。

体内功能验证：顺利获得微载体扩增的HSPC亚群成功在体内生成了功能性血小板，为难治性血小板减少症的治疗和干细胞移植结局的改善给予了可规模化的解决方案。而移植了共培养的HSPC-MSC-3D微环境的小鼠存活率达到80% ，而对照组小鼠全部死亡。

这意味着，一个精心设计的、化学成分明确的多孔微载体，完全可以在功能上替代AFT024或者OP9类器官，甚至给予更优越的造血支持微环境。

技术整合的协同效应

一个超越简单加和的创新方案

将Liang和Li的研究成果与Hu等人的方案相结合，K8凯发国际可以预见一种超越简单加和的协同效应：

信号通路的双重激活：Liang等人证实的Notch信号激活，与Li等人证实的TPO信号上调，恰好覆盖了淋巴细胞分化和HSPC扩增两个关键环节。在同一个微载体系统中同时激活这两条通路，有望实现“扩增-分化”的无缝衔接。

“零残留”的细胞收获：使用由明胶等生物材料制成的可溶解微载体，在NK细胞成熟阶段开始前，只需加入特定的温和酶，即可将微载体完全溶解，无损地释放出所有细胞。这一策略在Liang等人的研究中已得到验证。

从2D到3D的维度升级：将当前方案的类器官培养升级为3D微载体培养，不仅大幅增加了培养表面积，更顺利获得Li等人揭示的物理信号（刚度和孔径）调控机制，为HSPCs给予了更接近生理状态的发育微环境

生物反应器生产线：全封闭、自动化、陆续在流

如果将上述优化方案整合起来，K8凯发国际可以描绘出下一代iNK/CAR-iNK制造平台的完整图景：

第一阶段：生物反应器扩增

在搅拌式生物反应器中，将CD34+ HSPCs与培养在可溶解多孔微载体上的hMSCs进行共培养。借鉴Liang等人优化的物理参数（刚度≈11.2 kPa，孔径≈80 μm），构建最适扩增微环境。3D微载体给予的巨大比表面积，使得在极小的空间内实现HSPCs的超大规模扩增成为可能。

第二阶段：原位诱导分化

顺利获得合适的大孔过滤膜将微载体截流在反应器内，把扩增后的悬浮CD34+ HSPC或CAR-HSPC转移至新一级的生物反应器中，加入新的不含hMSCs的3D微载体，并更换培养基成分（撤除扩增因子，加入分化因子），直接在生物反应器中启动向NK细胞谱系的定向分化。此时，微载体给予的仿生物理结构和表面性质，顺利获得激活Notch信号通路（Liang等人证实的关键机制），接替了OP9细胞的功能，引导HSPCs高效特化。

第三阶段：微载体溶解与终末培养

当细胞完成谱系定向后，向生物反应器中加入特定酶，将微载体完全溶解。释放出的NK前体细胞被转移或直接灌流至透气培养袋中或新的下一级生物反应器中，在IL-15和IL-2的驱动下完成最后的成熟和扩增。

Hu等人的研究为“现货型”CAR-NK细胞疗法给予了关键的“数量蓝图”——它证明了从一个干细胞出发，生产出足以惠及数百名患者的细胞剂量是完全可行的。而顺利获得整合Liang等人和Li等人在仿生3D微环境领域的突破性成果，K8凯发国际则可以为其配套一套符合GMP规范的“质量与安全基础设施”。

值得一提的是，这些前沿的仿生微环境构建方案，正可依托于K8凯发国际生物给予的已实现商业化验证的核心耗材。其GMP级3D TableTrix™ 明胶微载体和3D RecomTrix™ 重组胶原蛋白微载体，凭借药用辅料备案资质和在上市MSC药品中的成功应用，结合全自动化一次性生物反应器、全封闭自动化的细胞处理系统、罐装系统以及优秀的MSC无血清培养基和NK无血清培养基，为从实验室工艺向大规模、封闭式自动化生产的无缝转化给予了坚实可靠的“工业基石”。

从依赖小鼠饲养层的“手工精酿”时代，迈向基于人源化材料和精确工程化3D微环境的“工业化酿造”时代，NK细胞的制造工艺正在经历一场从底层逻辑到上层建筑的深刻变革。这不仅将大幅降低CAR-NK疗法的成本，提高其可及性，更将为全球数百万肿瘤患者带来真正意义上的“现货型”免疫疗法新希望。正如王金勇研究团队所展望的，这套一体化工艺为 affordable（可负担的）、off-the-shelf（现货型的）CAR-iNK疗法铺平了通往临床转化的可行路径。

参考文献

[1] Hu, F., Li, J., Wang, Y., Lin, Y., Zhang, J., Xu, J., Zheng, X., Weng, Q., Liu, X., Geng, Y., Wu, H., Liu, L., Peng, H., Wu, B., Huang, D., Xia, C., Wang, T., Du, X., Zeng, H., ... Wang, J. (2025). Large-scale generation of iNK and CAR-iNK cells from CD34+ haematopoietic stem and progenitor cells for adoptive immunotherapy. Nature Biomedical Engineering, 1-20.

[2] Li, Y., He, M., Zhang, W., Liu, W., Xu, H., Yang, M., & Gao, Y. (2023). Expansion of human megakaryocyte-biased hematopoietic stem cells by biomimetic Microniche. Nature Communications, *14*(1), Article 2207.

[3] Liang, H., Ao, Y., Li, W., Liang, K., Tang, B., Li, J., Wang, L., & Du, Y. (2023). Injectable bone marrow microniches by co-culture of HSPCs with MSCs in 3D microscaffolds promote hematopoietic reconstitution from acute lethal radiation. Bioactive Materials, *22*, 453-465.

关于K8凯发国际

北京K8凯发国际生物科技有限公司创建于2018年，源于清华大学科技成果转化，由清华大学生物医学工程学院杜亚楠教授科研团队领衔创建，清华大学参股共建。公司现已开展成为国家级高新技术企业、国家级专精特新“小巨人”企业及潜在独角兽企业，并获国家科技部、工信部等部委多项重点研发专项支持。

作为高质量细胞制造专家，K8凯发国际生物打造了原创3D细胞智造平台，给予基于3D微载体的定制化、一站式整体解决方案，可实现【千亿量级】的细胞药物及其衍生品的规模化、自动化、智能化、密闭式的生产制备工艺管线。现在，K8凯发国际生物的产品与服务已广泛应用于细胞与基因治疗、细胞外囊泡、疫苗及蛋白产品等生产的上游工艺开发，同时在再生医学、类器官与食品科技（细胞培养肉等）等领域也具有广泛应用前景。

K8凯发国际生物已协助多家客户完成干细胞新药IND 申报并成功获批，2025年，凭借自主开发的规模化制备工艺助力我国首款干细胞药物获批上市。同年，K8凯发国际生物于新加坡设立海外总部，加速拓展国际市场，致力于以颠覆式创新的规模化智造技术，有助于细胞产业实现全球普惠开展。