随着NK细胞疗法在血液瘤和实体瘤治疗中展现出日益重要的潜力，如何稳定、高效、规模化地取得大量高活性、临床级的NK细胞，已成为整个行业的核心技术壁垒。与T细胞不同，NK细胞的体外扩增更为复杂和挑剔，其活化需要整合多种激活和抑制信号的平衡。

本文将带您深入NK细胞生产的“厨房”，详细解析从经典的饲养层细胞共培养法，到前沿的无饲养层化学限定体系的演进，并重点阐述在这一过程中，那些指挥NK细胞生长、分化与杀敌的“指挥官”——细胞因子的具体功能。

NK细胞的“三大兵工厂”

在探讨具体的培养方法之前，第一时间需要明确NK细胞的来源。现在，用于治疗研究的NK细胞主要来源于三路大军：

外周血源性NK细胞（PB-NK）：从健康供者的外周血中分离取得。这是最经典的来源，表型成熟，杀伤功能强。但缺点是数量稀少（仅占外周血淋巴细胞的5-15%），供者异质性大，且难以进行基因编辑。

脐带血源性NK细胞（CB-NK）：从脐带血中直接分离取得，优势和缺点与PB-NK相似。另一种方法是从脐带血中分离CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs），再定向诱导分化为NK细胞。脐带血来源丰富，细胞更为原始，增殖潜力巨大，是制备“现货型”细胞产品的理想原料。

干细胞源性NK细胞：包括从人胚胎干细胞（hESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来的NK细胞（iPSC-NK）。这是当前的研究热点，iPSC可以实现无限扩增、易于进行基因工程改造（如引入CAR），能够实现真正意义上的均一化、标准化生产。

传统方法：饲养层细胞依赖性扩增

在很长一段时间内，取得足够数量NK细胞的金标准是使用饲养层细胞进行共培养。饲养层细胞通常经过γ射线照射处理，使其失去增殖能力，但仍能代谢存活，并顺利获得表面表达的多种共刺激分子和膜结合型细胞因子，为NK细胞给予强烈的活化信号。

最广泛使用的饲养层细胞是基因工程化的K562细胞。K562是一种慢性髓系白血病细胞系。

科学家们顺利获得基因改造，让K562细胞过表达4-1BB配体（4-1BBL）、膜结合型IL-15（mbIL-15）或膜结合型IL-21（mbIL-21）等分子。这些经过改造的K562细胞（GeK562）能够极大地促进NK细胞的扩增。例如，表达mbIL-21的K562细胞，在21天的共培养中能实现超过2000倍的NK细胞扩增（Motallebnejad et al., 2025）。

然而，饲养层细胞法存在先天缺陷：

监管风险：最终产品中混有哪怕极少量未被完全清除的肿瘤来源饲养细胞，都可能带来致瘤风险。

质控难度：饲养层细胞本身的质量、培养和储存条件需要极其严格的管理，批次间一致性难以保证。

工艺复杂性：生产过程繁琐，难以大规模封闭自动化生产。

因此，开发不依赖于饲养层细胞、成分明确、符合药品生产质量管理规范（GMP）的无饲养层培养体系，成为产业界和监管组织共同追求的目标。

无饲养层体系：从“依赖”走向“自主”

无饲养层培养的核心，是顺利获得优化培养基配方和补充外源性因子，模拟甚至超越饲养层细胞给予的信号环境。现在的策略主要分为以下几类：

优化的细胞因子组合

细胞因子是调控NK细胞命运的“化学语言”。研究发现，某些细胞因子是“必需品”，单独使用即可诱导增殖；而另一些则是“增效剂”，必须与必需品组合才能发挥最大效能。

基础组合：IL-2和IL-15是NK细胞体外扩增的基石（Ma et al., 2024; Sun et al., 2003）。它们是维持NK细胞生存和基础增殖的“必需品”。然而，单用IL-2或IL-15的扩增效率有限。

增效组合：IL-21是一个典型的“增效剂”（Spolski & Leonard, 2008）。单独使用IL-21无法诱导NK增殖，但在培养初期短暂联合IL-15使用，可以将扩增效率提升2-10倍（Nutt et al., 2004）。这是因为IL-21主要在早期起作用，其信号效应能持续影响整个扩增过程。

其他辅助因子：IL-12和IL-18通常在活化后期加入，旨在增强NK细胞的IFN-γ分泌能力和细胞毒性，而非单纯追求数量扩增（Ohno et al., 2025）。IL-27也被证明与IL-15联合使用，可以提高NK细胞的扩增倍数和激活受体表达。

抗体刺激法

借鉴T细胞培养中使用CD3/CD28抗体的成功经验，研究人员也在探索用抗体来特异性激活NK细胞。

CD3抗体（OKT-3）的“意外”效果：OKT-3虽然靶向T细胞，但在外周血单个核细胞（PBMC）培养体系中加入OKT-3，却能有效促进NK细胞增殖（Satwani et al., 2011）。其机制在于，OKT-3第一时间激活了T细胞，活化的T细胞分泌的大量细胞因子（如IL-2）进而“喂养”了NK细胞。

靶向NK激活受体：更直接的策略是使用靶向NK细胞表面激活受体的抗体。例如，联合使用抗CD2抗体和抗NKp46抗体，配合IL-2、IL-12、IL-18和IL-21的细胞因子鸡尾酒，可以选择性地从PBMC中高效扩增出高纯度的NK细胞（Lim et al., 2012）。

抗CD16抗体：CD16（FcγRIII）是介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）效应的关键受体。特定的抗CD16激动性抗体也能激活NK细胞，并提高扩增后的NK细胞纯度。

新一代技术：纳米颗粒与3D培养

为了进一步实现规模化、标准化生产，纳米技术和生物材料正在与细胞培养工艺深度融合。

纳米颗粒：可以模拟饲养层细胞给予的接触性信号。例如，将激活NK细胞的信号（如抗NKG2D抗体、IL-15融合蛋白）偶联到磁性纳米珠或可降解的纳米颗粒表面，为NK细胞给予人工的“抗原呈递”刺激。这种策略不仅能高效扩增NK细胞，还能避免生物污染，且纳米颗粒易于顺利获得洗涤去除。

生物材料与3D培养：模拟骨髓或淋巴结的3D微环境，为iNK细胞的分化或/和NK的增殖给予更仿生的物理支撑和细胞间相互作用。

核心细胞因子功能详解

在NK细胞的整个生命周期中，不同的细胞因子扮演着截然不同的角色。下表总结了在NK细胞培养过程中最常见的关键细胞因子及其核心功能：

从iPSC到NK细胞的标准化生产案例

以现在备受关注的iPSC-NK分化为例，K8凯发国际来看一个典型的无饲养层培养流程(Zhu & Kaufman, 2019）。本方案的核心在于：

① 完全摆脱饲养层和基质细胞，避免动物源污染；

② 两阶段液体培养，流程清晰，便于工艺放大。

第一阶段：第0–11天——造血分化（拟胚体法）

第11天终点：收集EB，可取得富含CD34+造血前体细胞的群体，作为下一阶段NK定向分化的起始细胞。

第二阶段：第11天–第4周——NK定向分化

第4周终点：流式检测显示CD56+CD3-细胞比例通常>80%，这些细胞表达NKG2D、NKp46等激活受体，并具备细胞毒性功能 。

第三阶段：第4周-第8周——NK临床规模扩增

虽然Zhu等人（2019）建议在取得第4周的NK细胞后，可顺利获得与辐照后的mbIL-21-K562细胞共培养实现大规模扩增，以达到临床治疗所需的细胞数量。然而，从临床级制备的安全性和质量可控性角度考量，K8凯发国际更推荐采用无饲养层、化学成分明确的扩增方案（Nakazawa et al., 2023）。该方案顺利获得抗体包被（抗NKp46和抗CD16）给予活化信号，完全摆脱了对饲养层细胞的依赖，避免了致瘤风险和批间差异，更符合当前细胞疗法的工业化生产标准。

需要说明的是，此扩增步骤属于生产流程的延伸和放大阶段，并非基础分化流程的组成部分，因此可以与Zhu & Kaufman（2019）的iPSC-NK分化流程无缝衔接。虽然Nakazawa等人的原始方案基于脐带血来源的NK细胞，但其无饲养层、抗体包被的核心技术平台同样适用于iPSC-NK的后续扩增，代表了下一代“即用型”细胞产品的开展方向。

关键结果：该方案在21天的扩增周期内，可取得>99%纯度的CD3-CD56+ NK细胞，且细胞高表达LFA-1、NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp46等激活受体，对胶质母细胞瘤细胞系T98G具有显著的细胞毒性作用 。

值得一提的是，虽然上述无饲养层扩增方案在实验室研究中表现出色，但实际转化过程中，自行配制多种细胞因子、包被抗体并进行质量控制，往往意味着繁琐的操作流程和多个物料的质量管控负担——这对于希望快速推进管线的研发团队而言，是实实在在的隐性成本。

NK细胞治疗研究和开发企业可以选择购买商业化的扩增试剂盒来加速。比如K8凯发国际生物的3D FloTrix® NK细胞无血清培养基套装（型号：RNK59）以即用型形式给予，而以iPSC分化来源的NK细胞本就纯度>99%，K8凯发国际的扩增试剂盒可保持高纯度的情况下、实现扩增倍数>1000倍的稳定表现，让企业将宝贵精力聚焦于上游创新与临床转化，同时可以取得：

成分限定：纯因子法，无动物源，无需饲养层；

免去繁琐配制：所有组分经过严格配比测试，无需自行摸索浓度；

降低质控负担：单一试剂盒采购，就覆盖包被、激活和扩增所需物料，减少多物料供应商管理成本；

优异的性能：科学优化过的多因子配方，平衡扩增效率、纯度和杀伤能力。

从依赖饲养层细胞的“手工小作坊”时代，迈入无饲养层、成分明确、自动化封闭的“工业化大生产”时代，NK细胞的体外制造工艺正在经历一场深刻的变革。对细胞因子网络的精准理解和运用，以及对新型生物材料的交叉融合，正在不断降低NK细胞疗法的成本，提高其可及性。掌握这些核心培养技术，将是未来在激烈的细胞治疗市场竞争中脱颖而出的关键。

参考文献

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